[技術突破] 可以自己設計突變方式的CRISPR。20191026 Nature

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA

Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa, Luke W. Koblan, Jonathan M. Levy, Peter J. Chen, Christopher Wilson, Gregory A. Newby, Aditya Raguram & David R. Liu

Abstract

Most genetic variants that contribute to disease are challenging to correct efficiently and without excess byproducts. Here we describe prime editing, a versatile and precise genome editing method that directly writes new genetic information into a specified DNA site using a catalytically impaired Cas9 fused to an engineered reverse transcriptase, programmed with a prime editing guide RNA (pegRNA) that both specifies the target site and encodes the desired edit. We performed more than 175 edits in human cells including targeted insertions, deletions, and all 12 types of point mutation without requiring double-strand breaks or donor DNA templates. We applied prime editing in human cells to correct efficiently and with few byproducts the primary genetic causes of sickle cell disease (requiring a transversion in HBB) and Tay-Sachs disease (requiring a deletion in HEXA), to install a protective transversion in PRNP, and to insert various tags and epitopes precisely into target loci. Four human cell lines and primary post-mitotic mouse cortical neurons support prime editing with varying efficiencies. Prime editing offers efficiency and product purity advantages over homology-directed repair, complementary strengths and weaknesses compared to base editing, and much lower off-target editing than Cas9 nuclease at known Cas9 off-target sites. Prime editing substantially expands the scope and capabilities of genome editing, and in principle could correct about 89% of known pathogenic human genetic variants.

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不需要雙股DNA斷裂或者是外源性DNA的尋找並取代的基因編輯

摘要

要利用基因編輯來克服大多數引發疾病的基因變化，通常很難達到高效率以及沒有副產物（副作用）。在此，我們闡述了一種多功能並且專一的基因編輯方式。利用催化區域有缺陷的Cas9蛋白質，來和特別設計過的反轉錄脢連結，同時表達一段主要的編輯RNA （pegRNA）來辨認特定DNA，並且直接“寫入”新的基因訊息。我們在人類細胞中，在不需要雙股DNA斷裂或者是其他外援性DNA模板的情況下，施行了超過175個編輯，包含寫入，刪除以及作出12種不同的點突變。我們在人類細胞中以直接編輯的方式，在產生少許副產物的狀況下，有效率的導正鐮刀型血球疾病（需要HBB基因中有鹼基倒轉）以及戴薩克斯症（需要在HEXA基因中有一段缺失），並且在PRNP基因（產生prion的基因，可能導致帕金森氏症）植入一段保護性質的鹼基轉換，最後將多種不同的標記或是抗原表位準確地插入目標位置。對於人類細胞以及後有絲分裂的小鼠皮質神經細胞，編輯的效率有些許的差異。與利用同源性DNA為基礎的修復方式相比，直接編輯的方式提供了一個高效率及高純度產物的優勢，而與單個鹼基編輯的方式相比，又補足了它的能力與缺點，並且相較於傳統的Cas9核酸脢，在已知的Cas9非專一性目標基因上，有極低的非專一性編輯。直接編輯法大幅的擴充了基因編輯的潛力與可能，並且在理論上可以導正大約89%人類的致病性基因突變。

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＊越來越多嶄新的基因編輯技術發表了，這次的技術突破在於，可以直接依照想要的方式編輯基因。以往較常使用的CRISPR/Cas技術，通常都是利用細胞自己的修復機制（其中比較容易出錯的機制）來製造基因突變，然而如果是要“修復”基因，這個方法並不實用。新的這個方法，在概念上是導入了一個反轉錄脢以及一段編輯RNA，然後會自然地在編輯的時候，寫入希望的編輯。令人覺得好奇的是，是否在其他物種中，也能夠順利地做出相要的編輯？也許未來也會在植物領域看到這樣的方式，這樣對於基因功能性研究，將會是一大福音。