[技術突破] 利用有組織特異性的促進子來表達CRISPR/Cas9，以達到在特定植物組織的基因突變 20190930 The Plant Cell

CRISPR-TSKO: A Technique for Efficient Mutagenesis in Specific Cell Types, Tissues, or Organs in Arabidopsis

Ward Decaestecker#, Rafael Andrade Buono#, Marie L. Pfeiffer, Nick Vangheluwe, Joris Jourquin, Mansour Karimi, Gert Van Isterdael, Tom Beeckman, Moritz K. Nowack, and Thomas B. Jacobs

ABSTRACT

Detailed functional analyses of many fundamentally important plant genes via conventional loss-of-function approaches are impeded by the severe pleiotropic phenotypes resulting from these losses. In particular, mutations in genes that are required for basic cellular functions and/or reproduction often interfere with the generation of homozygous mutant plants, precluding further functional studies. To overcome this limitation, we devised a CRISPR-based tissue-specific knockout system, CRISPR-TSKO, enabling the generation of somatic mutations in particular plant cell types, tissues, and organs. In Arabidopsis thaliana, CRISPR-TSKO mutations in essential genes caused well-defined, localized phenotypes in the root cap, stomatal lineage, or entire lateral roots. The modular cloning system developed in this study allows for the efficient selection, identification, and functional analysis of mutant lines directly in the first transgenic generation. The efficacy of CRISPR-TSKO opens avenues for discovering and analyzing gene functions in the spatial and temporal contexts of plant life while avoiding the pleiotropic effects of system-wide losses of gene function.

---

CRISPR-TSKO: 在阿拉伯芥的特定細胞、組織、或器官中，有效產生基因突變的技術

摘要：

對於許多在生理上是必需的基因，當經由傳統的基因缺失方法來研究時，經常會因為所有細胞中的功能失調，導致嚴重的性狀（胚胎死亡或停止生長）而無法進行分析。特別是當這些目標基因是對於細胞內功能以及/或生育能力有相關重要性的時候，經常導致無法產生同型合子的突變後代，所以無法更加了解其功能。為了克服這個障礙，我們設計了一個以CRISPR為基礎，在特定細胞形態中剔除基因的系統，稱為CRISPR-TSKO (Tissue Specific Knock Out, 特定組織剔除）。這個系統能夠在指定的細胞型態、組織、或是器官中引發體細胞的基因突變（剔除）。在阿拉伯芥中，CRISPR-TSKO可在根冠、保衛細胞家族、或整個側根製造必要基因的突變而引發局部的突變性狀。而在這個研究中所研發的系統模組，允許研究人員直接在第一代的轉殖植物中，有效的篩選、辨識、並且針對功能性來分析這個基因的功能。這個CRISPR-TSKO的高效能，替能夠避免因為整體性的基因缺失而帶來嚴重性狀而在特殊時間點與空間範圍內，做基因功能性分析的可能性，開啟了一個新的紀元。

利用只在側根表現的促進子來剔除綠色螢光蛋白基因

原文連結： http://www.plantcell.org/content/early/2019/09/27/tpc.19.00454

---

小心得：

這個系統其實說穿了，是一個快速的克隆系統，利用只在特定組織表現的促進子來表現CRISPR/Cas9系統。在這篇研究中，研究了根冠、測跟、以及氣孔，功能似乎很顯著也容易研究。然而，真正已知無法產生配子（精、卵）相關的基因，或者是會造成整體性的生理變化的（例如代謝相關）的基因，是否真的可以以這個系統來研究，仍然有待觀察。我個人覺得這個系統還有可以改進的空間，也許未來，會有機會真的能看到可以在特定時間或組織，研究目前還無法研究的基因功能的好系統。